Nutrición y Requerimientos de Bacillus subtilis en la Acuicultura de Camarón
La acuacultura de camarón ha experimentado una expansión significativa a nivel mundial, convirtiéndose en una industria altamente tecnificada. Sin embargo, la intensificación de los sistemas de cultivo ha generado estrés en los organismos, deterioro del medio ambiente y la proliferación de enfermedades. Ante esta problemática, se han intensificado las investigaciones para promover un crecimiento saludable de los organismos y desarrollar estrategias respetuosas con el medio ambiente, como el uso de probióticos.
El Rol de los Probióticos en la Acuicultura
Los probióticos son microorganismos vivos que se utilizan como aditivos alimenticios y que pueden mejorar la biota microbiana gastrointestinal, la digestión, el crecimiento, la resistencia a enfermedades y la calidad del agua en los cultivos. Debido a que mejoran el crecimiento, la supervivencia y la salud del camarón al favorecer el sistema inmune, los probióticos son empleados en el cultivo de diversas especies de camarón tales como: Fenneropenaeus indicus, Litopenaeus vannamei, Marsupenaeus japonicus y Penaeus monodon, entre otras. Además, puede disminuir la tasa de conversión alimenticia gracias a la producción de enzimas digestivas (amilasas, celulasas, fitasas, glicosidasas, lipasas, proteasas).
Algunos probióticos contienen beta-glucanos, quitina, mano-proteína y ácidos nucleicos que estimulan a los hemocitos, los cuales a su vez fomenta la respuesta inmune en los camarones. Especies como Bacillus cereus, B. licheniformis, B. subtilis y B. natto, Candida sake, C. tropicalis, Debaryomyces hansenii, Rhodotorula rubra, R. glutinis, Rhodosporidium paludigenum, Saccharomyces cerevisiae y S. commune son las más empleadas como probióticos en camarón.
El efecto de los probióticos en camarón es un área potencial de investigación que puede generar herramientas para mejorar el desarrollo de esta industria. El presente trabajo evaluó la factibilidad de emplear cepas de bacilos o levaduras como aditivos alimenticios a fin de mejorar los parámetros de producción y sistema inmune de juveniles de L. vannamei.
Materiales y Métodos Utilizados
Se utilizaron dos mezclas probióticas, una de bacilos aisladas de hepatopáncreas de camarón L. vannamei [B. tequilensis (YC5-2), B. endophyticus (YC3-b) y B. endophyticus (C2-2)] y una de levaduras [C. insectorum (DH5), D. hansenii (DH6 y L1]. Los microorganismos fueron recuperados de crioconservación (-80 °C) y cultivados en placas de TSA+2,5% NaCl a 37 °C por 24 h o PDA a 30 °C por 24 h, dependiendo del caso. Las colonias fueron extraídas del agar, suspendidas en 10 mL de solución salina estéril, 3% NaCl hasta alcanzar una absorbancia de 1,0 a 540 nm, equivalente a 1x109 UFC mL-1 de bacilos y de 1,0 a 600 nm equivalente a 3x107 UFC mL-1 de levaduras.
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Para la fabricación de la dieta experimental (DE) se utilizaron los ingredientes señalados en la Tabla 1, los cuales fueron pulverizados, tamizados (250 µm) y almacenados a 4 °C en bolsas de plásticos selladas dentro de cubetas herméticas. La dieta fue formulada con el programa NutrionMR y suplementada con metionina, lisina y treonina. Una dieta comercial (DC) con 35% proteína (PIASA S.A. de C.V.) fue utilizada como control.
Los pellets elaborados (2 mm de diámetro) fueron cortados manualmente y secados en una estufa con flujo de aire (37 °C) hasta obtener una humedad aproximada del 10%. La mezcla de bacilos o levaduras fue incorporada a la DE por aspersión (106 UFC mL-1), secando el alimento a 37 °C. La DC y las dietas con bacilos (DB) y levadura (DL) fueron embolsadas por separado, etiquetadas, almacenadas a 4 °C y analizadas para proteína cruda (PC), extracto etéreo (EE), fibra cruda (FC), humedad (H), ceniza (C) y extracto libre de nitrógeno (ELN).
Los camarones (L. vannamei) fueron aclimatados durante 15-20 días en tanques de 1.500 L a 29 °C, 35 de salinidad y fueron alimentados ad libitum dos veces al día (10 y 16 h) con alimento comercial (35% proteína). El sistema de cultivo consistió en 12 acuarios de 60-L con malla mosquitero para evitar la fuga de camarones. Cada acuario tenía un calentador sumergible de 200 W para mantener el agua a 28 ± 0,5 °C; suministro de aire (oxígeno disuelto ≥ 5 mg L-1) y agua marina filtrada y expuesta a UV (35 ppm, 5 (m). Para el bioensayo de 45 días, se utilizaron camarones con un peso inicial promedio de 0,14 ± 0,02 g, colocados aleatoriamente a una densidad de 10 camarones/acuario con tres réplicas (acuarios) por tratamiento (n= 120). Los camarones tuvieron una aclimatación de dos días antes de iniciar el bioensayo. Se les suministró el alimento al 10% de la biomasa ajustando el consumo diariamente hasta presentar un excedente. El alimento fue distribuido en tres raciones al día (09:00, 13:00 y 17:00 h). Diariamente se eliminaron mudas, camarones muertos y restos de alimento por sifoneo. Se realizó un recambio diario del 60% de agua, las biometrías fueron a los 15, 30 y 45 días de cultivo, pesando cada camarón del acuario en una balanza analítica (0,001 g) después de secarlos cuidadosamente. Se evaluó peso promedio final, tasa de supervivencia (TS= 100 x (número final de camarones) / (número inicial de camarones), consumo aparente de alimento (CAA= alimento proporcionado - alimento residual) y tasa de conversión alimenticia (TCA= total de alimento consumido / peso ganado).
Se extrajo la hemolinfa de 6 camarones tomados al azar por tratamiento. Esta fue extraída de la base del pleópodo del primer segmento abdominal con una jeringa (3,0 mL) con 500 µL de solución anticoagulante con 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM EDTA-Na2, 10 mM HEPES, pH 7,3, 850 mOsm kg-1 a 4 °C , depositándola en tubos Eppendorf estériles mantenidos en una cama de hielo. Cien microlitros (100 µL) de hemolinfa se mezclaron con 400 µL de solución fijadora (anticoagulante + formaldehido, al 10%) para fijar los hemocitos, observándolos bajo el microscopio y cuantificándolos con una cámara Neubauer como conteo total de hemocitos por mililitro (CTH).
El peso promedio final, TS, CAA, TCA y CTH fueron normales y homocedásticos por lo cual fueron evaluados utilizando un análisis de varianza ANOVA y una prueba a posteriori de Tukey.
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Resultados Obtenidos
Los parámetros fisicoquímicos del agua poseen una gran relevancia en acuacultivos ya que influyen directamente en los requerimientos, crecimiento, metabolismo y toda actividad fisiológica de los camarones. El comportamiento de los parámetros fisicoquímicos del agua evaluados en la presente investigación (5,44 ± 0,3 a 5,84 ± 0,73 mg L-1 de oxígeno y 28,5 ± 0,2 °C) no presentaron variaciones importantes que generaran condiciones adversas al cultivo, estando dentro de los rangos normales sugeridos para la especie.
La dieta comercial (DC) registró 35, 8, 3, 8, 8 y 38% de proteína cruda (PC), extracto etéreo (EE), fibra cruda (FC), humedad (H), ceniza (C) y extracto libre de nitrógeno (ELN), respectivamente, mientras que la DE reveló 37,7; 9,35; 1,13; 7,55 y 44,23% de PC, EE, FC, C y ELN, respectivamente. El análisis proximal inicial de las dietas elaboradas (datos no presentados) no mostró cambios en el contenido nutrimental de las dietas experimentales comparado con la dieta control debido a la aplicación de los probióticos (Bacilos o levaduras).
La calidad nutricional de los ingredientes, aunado a un mejor entendimiento de los requerimientos nutricionales de los organismos, permiten diseñar formulaciones específicas eficientes que mejoran el crecimiento y salud de los organismos bajo cultivo, fomentando a su vez una industria sustentable. Los camarones alimentados con la dieta experimental (DE) mostraron una diferencia significativa (P < 0,05) en peso final, CAA y TCA con respecto a aquéllos alimentados con la dieta control (Tabla 2). Esta diferencia puede deberse a la adición de los aminoácidos esenciales y/o una mayor frescura de los ingredientes al momento de fabricar la DE, que pudo fomentar una mejor digestión y absorción de los nutrientes.
Cabe señalar que las dietas comerciales buscan una buena relación entre costo/beneficio lo que ocasionalmente afecta su calidad. El peso promedio final (2,7 g) y CAA (2,2 g) de los camarones alimentados con la DC presentó valores significativamente inferiores (P > 0,05) comparadas con DB (4 y 5,9 g) y DL (4,2 y 6,1 g). Los tratamientos DB (83,3) y DL (93,3) mostraron valores más altos de supervivencia total comparados a DC (63,3), sin embargo, solo la DL registró diferencia significativa entre tratamientos (Tabla 2).
Resultados similares han sido observados para L. vannamei alimentados con probióticos. Emplearon cepas probióticas de Bacillus sp. (P64), Vibrio heparinus (P62) y V. alginolyticus (LLi), registrando un incremento significativo en el peso promedio de los camarones con respecto a la dieta control (2,8-3,0 y 2,2 g de peso promedio, respectivamente), así como una mejora en la respuesta inmune de L. vannamei (5,1-5,9 y 4,7 de índice inmune, respectivamente). Emplearon levadura (Rh. paludigenum) como agente probiótico en L. vannamei, encontrando una mejora significativa en peso final comparado con el control (4,1 y 3,6 g, respectivamente). También observaron una mayor actividad antioxidante e inmunológica de diversos factores presentes en la hemolinfa del camarón.
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Los hemocitos generan productos antimicrobianos de importancia para el sistema inmune y llevan a cabo procesos como fagocitosis o actividades de encapsulación que generan cambios en el número total de hemocitos circulantes. Es por ello, que el incremento de estas células inmunocompetentes en hemolinfa se asocia a un efecto inmunoestimulante de los aditivos utilizados en el alimento. En el presente estudio, el conteo total de hemocitos (CTH) mostró que los camarones tratados con levaduras (DL) fue significativamente superior (P > 0,05) comparado con la dieta comercial (Fig. 1).
Investigaciones del sistema inmune de camarones han demostrado que es posible aumentar el CTH y resistencia a patógenos mediante la ingestión de aditivos alimentarios, ya que éstos pueden ser empleados como inmunoestimulantes. Se ha reportado que dietas con cepas vivas de levaduras y sus derivados estimulan el sistema inmune de camarones, elevando el número y actividad de hemocitos al incluir 0,1% de β-glucanos en la dieta. evaluaron el efecto de tres cepas de D. hansenii sobre la respuesta inmune de L.
Conteo total de hemocitos circulantes en juveniles de camarón L. vannamei alimentados con 4 diferentes dietas. Letras distintas indican diferencias significativas (P < 0,05). DC: Dieta comercial, DE: Dieta experimental sin probióticos, DB: Dieta experimental+Bacilos, DL: Dieta experimental+levadura
Algunos trabajos previos recomiendan las mezclas de cepas probióticas, ya que son más efectivas que las cepas independientes, debido a su efecto sinérgico que favorece diferentes procesos que pueden mejorar la producción, crecimiento, salud, y condición inmune de los camarones. Las mezclas probióticas también influencian la actividad en la síntesis de vitaminas o cofactores, mejora la digestión de proteínas y otros ingredientes que fomentan la absorción de nutrientes. señalan que estas cualidades de los probióticos influyen en el bienestar de los organismos, mientras que y señalan que los cultivos de camarones son altamente dependientes de la microbiota del tracto digestivo.
Este trabajo reveló que la dieta experimental (DE) mejoró peso final, consumo aparente de alimento (CAA) y tasa de supervivencia (TS) respecto a la dieta comercial (DC). La inclusión de levaduras o bacilos (DL o DB) a una concentración de 1x106 UFC mL-1 en el alimento (DE), mejoró peso final, CAA, tasa de supervivencia (TS) y conteo total de hemocitos circulantes (CTH) respecto a la DC en juveniles de L. vannamei. Es necesario realizar más estudios para mejorar el entendimiento sobre la relación de los probióticos con la nutrición y el sistema inmune.
LA IMPORTANCIA DE PROBIÓTICOS EN PISCICULTURA
| Componente | Dieta Comercial (DC) (%) | Dieta Experimental (DE) (%) |
|---|---|---|
| Proteína Cruda (PC) | 35 | 37.7 |
| Extracto Etéreo (EE) | 8 | 9.35 |
| Fibra Cruda (FC) | 3 | 1.13 |
| Humedad (H) | 8 | 7.55 |
| Ceniza (C) | 8 | 44.23 |
| Extracto Libre de Nitrógeno (ELN) | 38 | N/A |
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